二手熒光定量PCR儀是一種可以實(shí)時(shí)檢測核酸擴(kuò)增的技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化對PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以此實(shí)現(xiàn)對初始模板的定量分析。無需參比染料，無需定期校準(zhǔn)，采用歸一化算法，快速準(zhǔn)確直觀的呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用戶使用方便簡潔。我們在做熒光定量PCR時(shí)提到的三個(gè)名稱：擴(kuò)增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線，熔解曲線。
?。?）擴(kuò)增曲線：擴(kuò)增曲線有兩種展現(xiàn)形式，一種是線性，一種是對數(shù)形式。我們通常是用CT來推算樣品中樣品的濃度。CT值越高說明模板濃度越低。上面也詳細(xì)說明了原理，在這里就不過多贅述。
?。?）標(biāo)準(zhǔn)曲線：將已知濃度的樣品（標(biāo)準(zhǔn)品）經(jīng)過梯度稀釋后分別取樣進(jìn)行熒光定量PCR，得到的一系列的Ct值，用這個(gè)Ct值與Log模板數(shù)對應(yīng)可以得到一個(gè)相關(guān)的曲線，我們叫標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢杂眠@個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的一些參數(shù)來判斷這個(gè)熒光定量PCR體系的優(yōu)劣。
?。?）熔解曲線：Tm值，MeltingTemperature（解鏈溫度），PCR雙鏈產(chǎn)物的退火溫度。這兩個(gè)圖是在熒光定量PCR結(jié)束后，對產(chǎn)物進(jìn)行逐步升溫時(shí)進(jìn)行的監(jiān)測，可以看到在達(dá)到其解鏈溫度時(shí)，熒光信號會有一個(gè)忽然的下降。我們將測得的這個(gè)曲線叫做熔解曲線。理論上如果PCR得到特異性產(chǎn)物則只有一個(gè)Tm值，在溶解曲線上表示只有單峰存在。如果是多相峰，那么可以判斷產(chǎn)物不是單一的，發(fā)生了非特異擴(kuò)增。
